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DAPI与FITC在细胞粘附及骨架结构检测中的应用

更新时间: 2024-12-27 11:38:08  查看次数: 94    
DAPI是细胞粘附实验里用的一种蓝色荧光染料。它能跟细胞核里的DSDNA发生反应,在特定波长光的照射下会显示出蓝色,用来表示试样表面对细胞的粘附能力。细胞粘附检测方法是这样的:把一定浓度的细胞接种到试样表面,然后在细胞培养箱里分别培养0.5小时、1小时、4小时。之后,把培养基去掉,用无菌PBS清洗试样表面,把残留的MEM培养基以及没黏附的细胞都洗掉。清洗完后,用移液枪往样品表面滴加4%的多聚甲醛,静置40分钟,多聚甲醛的作用是固定细胞。固定好后,用PBS清洗试样表面三次,把试样转移到新的孔板里。染色的时候,在避光条件下,把50微升的DAPI染色剂分别滴到每个试样上,让染色剂覆盖整个试样表面,然后在避光条件下染色10分钟。拍摄前用PBS清洗试样,用激光共聚焦显微镜观察,随机选取视野拍荧光照片。
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为了评估细胞骨架结构和细胞核的完整性,我们用FITC和DAPI这两种荧光染料混合染色。这样就能直接观察到细胞在试样表面的生长情况。FITC可以跟细胞里的纤维蛋白特异性结合,而DAPI能标记出细胞核的位置。细胞骨架复染测试方法是这样的:首先,把一定浓度的细胞接种到试样表面。在培养箱里培养完实验所需时间后,用移液枪吸掉培养基,用无菌PBS慢慢清洗试样表面,把试样转移到新的孔里。然后用多聚甲醛固定细胞,固定方法跟前面一样。其次,固定好后,用PBS把试样表面的多聚甲醛洗掉,再把试样转移到新的多孔板里,接着用移液枪吸取50微升的FITC荧光染色剂滴到试样表面,在避光条件下静置染色1小时,完成FITC染色。最后,用PBS把FITC染色剂洗掉,再滴加50微升的DAPI染色剂到试样表面,尽量让染色剂铺满试样表面,在避光条件下静置10分钟完成染色,用PBS把多余染色剂去掉。这样整个复染过程就完成了。用激光共聚焦显微镜观察,随机选取视野拍荧光照片。
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MTT检测的原理是MTT被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原成水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒,并且沉积下来,死细胞没办法还原。甲瓒能被二甲基亚砜(DMSO)溶解,用酶标仪在特定波长处测量它的光吸收值。在一定细胞数量范围内,MTT结晶形成的量跟细胞数量成正比。根据测得的吸光度值(OD值)来判断活细胞数量,OD值越大,细胞活性越强。通常MTT配成的终浓度是5mg/mL,用PBS配制。MTT的结果跟活死实验相吻合,不同接枝度的CHI - MA水凝胶的细胞活性跟对照组比没有明显区别。这进一步证明了甲基丙烯酰化的壳聚糖水凝胶具有良好的细胞相容性。细胞刚接种到水凝胶表面时,细胞对水凝胶表面的粘附能力会对后续细胞行为产生明显影响。不管哪种接枝度的水凝胶,随着时间推移,粘附在水凝胶表面的细胞都逐渐增多,这说明内皮细胞在CHI - MA水凝胶表面有良好的粘附效果。这有利于细胞在三维支架内部的生长和增殖。在水凝胶表面培养一天后,细胞呈现纺锤体形状,细胞铺展了很大面积,而且细胞伪足伸长,细胞之间通过伪足相互连接。这就表明内皮细胞在CHI - MA水凝胶表面能很好地铺展,从而实现细胞功能。